Auf Wunsch seines Vaters absolvierte Dassler bei den „Vereinigten Fränkischen Schuhfabriken vorm. Max Brust vorm. B. Berneis AG“ in Herzogenaurach ab 1911 eine Lehre zum Schuhmacher. Zu Beginn des Ersten Weltkriegs wurde er zum Kriegsdienst eingezogen und in Flandern eingesetzt. Bei Kriegsende kehrte er leicht verletzt nach Franken zurück und sammelte in den nächsten Jahren unterschiedliche berufliche Erfahrungen. Er ließ sich bei der Münchner Gendarmerie ausbilden, erwarb anschließend in einer Porzellanfabrik kaufmännische Kenntnisse und arbeitete 1920 bei der Ledergroßhandlung Karl Schmidt in Nürnberg. Noch im selben Jahr ging er zurück nach Herzogenaurach, wo sein Bruder Adolf Dassler (1900–1978) (Sport-)Schuhe produzierte. Beide leiteten seit 1923 die kleine Werkstatt, die ein Jahr später unter dem Namen GeDa – Gebrüder Dassler Sportschuhfabrik in das Handelsregister eingetragen wurde.

Dassler brachte v. a. seine kaufmännische Expertise und sein Verkaufstalent in den Familienbetrieb ein, der bis in die späten 1930er Jahre zum größten deutschen Sportschuhhersteller aufstieg. Sein berufliches Netzwerk half dem Familienunternehmen besonders in den ersten Jahren weiter: So unterstützte sein ehemaliger Arbeitgeber, die Nürnberger Lederfirma, das junge Unternehmen mit Krediten und half, neue Märkte für die Sportschuhe zu erschließen. Dabei beobachtete er v. a. die Innovationen ausländischer Firmen und baute seit 1928/29 das Auslandsgeschäft mit auf. Dassler wurde 1933 NSDAP-Mitglied.

Während des Zweiten Weltkriegs wuchs die Entfremdung zwischen den Brüdern. Dassler leistete seit März 1943 Kriegsdienst beim Zollgrenzschutz der Reichsfinanzverwaltung an der deutsch-polnischen Grenze und war an unternehmerischen Entscheidungen nicht mehr nennenswert beteiligt. Er scheiterte mit seinem Versuch, aus dem Kriegsdienst entlassen zu werden, ebenso wie mit seiner Absicht, einen Springerstiefel für Fallschirmjäger zu entwickeln; das Unternehmen wurde im November 1943 Zulieferer des Waffenherstellers Schricker & Co.

Nachdem Dassler in den letzten Kriegsmonaten wahrscheinlich in Diensten der Gestapo gestanden hatte, nahm ihn das Counter Intelligence Corps, die Spionageabwehr der US-Armee, am 17. Juli 1945 in Haft und internierte ihn vom 5. August 1945 bis zum 31. Juli 1946 in ihrem Gefangenenlager Hammelburg Nr. 9 unter dem nicht nachgewiesenen Verdacht, auch dem Sicherheitsdienst der SS angehört zu haben. Dassler machte für seine Internierung seinen Bruder Adolf verantwortlich, der gegenüber den Besatzungsbehörden behauptet habe, dass er Mitglied des Sicherheitsdienstes gewesen sei.

Die beiderseitigen Verdächtigungen entzogen einer weiteren Zusammenarbeit den Boden und führten 1948 zur Auflösung der Gebr. Dassler Schuhfabrik. Gemäß Teilungsvertrag übernahm Dassler, den die zuständige Spruchkammer im Februar 1947 als „Mitläufer“ einstufte, das frühere Fabrikgebäude der Gebr. Dassler an der Würzburgerstraße 13 in Herzogenaurach. Im Juli 1948 nahm die renovierte Rudolf Dassler Schuhfabrik (RUDA) mit 15 Beschäftigten die Produktion von Sportschuhen auf, der Firmenname wurde im Oktober 1948 geändert in PUMA Schuhfabrik, nachdem das Nürnberger Werbebüro von Friedrich Krams einen springenden Puma als Firmenlogo kreiert hatte. Dassler war Geschäftsführer, 1958 wurden seine Frau und seine beiden Söhne Teilhaber der 1959 in PUMA Schuhfabrik KG umbenannten Firma.

Zwischen den Unternehmen PUMA und adidas, der Firma seines Bruders Adolf, begann eine jahrzehntelange Konkurrenz um Marktanteile in der Sportbranche, gestützt auf Kreativität bei der Gestaltung neuer Schuhmodelle, technische Kompetenz und die Pflege eines Netzwerks mit Sportlern und Sportlerinnen sowie Sportfunktionären. Ein schnelleres Wachstum der Firma wurde dadurch erschwert, dass Dassler es ablehnte, Fußball-Bundestrainer Sepp Herberger (1897–1977), der PUMA als Ausstatter für die Nationalmannschaft gewinnen wollte, das geforderte monatliche Honorar von 1000 D-Mark für dessen Vermittlerdienste zu bezahlen. Damit trieb er Herberger in die Arme seines Bruders Adolf, der die Summe zahlte.

Gleichwohl gewann die PUMA Schuhfabrik im Fußballsport und in der Leichtathletik an Bedeutung. Die mit Schraubstollen ausgestatteten, neu entwickelten Fußballschuhe „Super Atom“ (1952/53) und „Brasil“ (1954) wurden von mehreren Spitzenspielern genutzt. Mit dem Sprinter Heinz Fütterer (1931–2019) stattete PUMA seit 1954 einen international erfolgreichen Sportler aus. Technische Innovationen kamen hinzu: So bediente sich PUMA der Vulkanisationstechnik, die Sohle und Schaft fest miteinander verband (1960).

In den 1960er Jahren stellte Dassler sein Unternehmen internationaler auf und schloss spektakuläre Verträge mit dem brasilianischen Weltstar Pelé (geb. 1940) und dem portugiesischen Ausnahmestürmer Eusébio (1942–2014). Er gründete 1962 eine Tochtergesellschaft in Österreich und in den nächsten zehn Jahren Niederlassungen in Frankreich, Jugoslawien, Australien und Nigeria. Mit der Produktion von Fußballtrikots stieg PUMA 1973 in den Sportbekleidungsmarkt ein.

Der Kampf um Spitzensportler mit immer höheren Geldsummen und der fortdauernde juristische Streit mit adidas um vermeintliche Patentverstöße führten PUMA 1970 vorübergehend in die Verlustzone. Der Wettbewerb auf dem Sportartikelmarkt verschärfte sich, auch durch niedrigpreisige Plagiate von Schuhen und Bekleidung sowie durch Konkurrenz aus den USA (Blue Ribbon Sports, 1971 Nike), was die Position von PUMA als wichtigstem Konkurrenten von Weltmarktführer adidas zunehmend gefährdete. Nach dem Tod Dasslers und einem Rechtsstreit der Söhne über sein Testament trat Dasslers Sohn Armin (1929–1990) im Januar 1975 als geschäftsführender Gesellschafter die Nachfolge an.